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如何更好的理解光譜流式中的擴(kuò)散誤差（Spreading Error）
上篇：原理篇
光譜流式細(xì)胞儀可捕獲熒光染料的完整發(fā)射光譜，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)弱表達(dá)marker的檢測(cè)和重疊熒光信號(hào)的分離。然而，當(dāng)來(lái)自不同熒光染料的信號(hào)未被準(zhǔn)確分離時(shí)，光譜流式結(jié)果可能會(huì)受到解混誤差（Unmixing error）和溢出擴(kuò)散誤差（Spillover spreading error）的影響，進(jìn)而導(dǎo)致數(shù)據(jù)質(zhì)量不佳，這些問(wèn)題在復(fù)雜的多色Panel中尤為常見(jiàn)。CytoFLEX mosaic光譜檢測(cè)模塊利用高分辨率光譜數(shù)據(jù)和單染樣本對(duì)照，通過(guò)先進(jìn)的光譜解析算法，為準(zhǔn)確的識(shí)別和解析不同熒光染料，提供了更好的解決方案。
Unmixing Error
在光譜流式細(xì)胞儀中，當(dāng)我們?cè)谑褂酶囝伾腜anel時(shí)，遇到的一大挑戰(zhàn)就是Unmixing Error（如圖1）。這個(gè)問(wèn)題源于熒光染料的光譜在參考對(duì)照與實(shí)驗(yàn)樣品中的不準(zhǔn)確匹配。因?yàn)楣庾V流式細(xì)胞儀依靠算法來(lái)解析具有重疊發(fā)射光譜的熒光染料，因此即使很小的光譜不匹配也會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)的顯著誤差。
圖1：Unmixing Error示例，如箭頭指示，在細(xì)胞群中表現(xiàn)為傾斜的模式
Unmixing Error嚴(yán)重的后果之一是Spreading Error的增加，即來(lái)自明亮熒光染料的信號(hào)被錯(cuò)誤地分配到其他檢測(cè)通道。這種錯(cuò)誤分配會(huì)導(dǎo)致背景噪聲升高，降低弱表達(dá)或稀有細(xì)胞群的分辨能力，引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度和分辨率總體下降。
Unmixing Error會(huì)扭曲熒光強(qiáng)度分布，導(dǎo)致信號(hào)分配不準(zhǔn)確；設(shè)門(mén)不正確，以及樣品或?qū)嶒?yàn)之間的可變性增加，比如樣本制備的重復(fù)性等，這些因素共同降低了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。
值得注意的是，雖然光譜不匹配是Unmixing Error的主要驅(qū)動(dòng)因素，但其他因素包括不合適的單染對(duì)照，串聯(lián)染料的不穩(wěn)定性，自發(fā)熒光的產(chǎn)生，儀器穩(wěn)定性和不合適的光譜矩陣計(jì)算同樣也會(huì)有影響（如圖2所示）。因此更好的應(yīng)對(duì)Unmixing Error需要謹(jǐn)慎注意Panel設(shè)計(jì)，熒光染料的選擇，以及使用能更好匹配實(shí)驗(yàn)樣本的高質(zhì)量單染對(duì)照。
圖2：Overview of Unmixing Error in Flow Cytometry. This schematic diagram illustrates the concept of Unmixing Error through three interconnected sections: Causes, Consequences, and Mitigation
Spillover Spreading Error
溢出擴(kuò)散誤差（Spillover Spreading Error) ，源于熒光檢測(cè)的物理和統(tǒng)計(jì)性質(zhì)。當(dāng)一種熒光基團(tuán)的信號(hào)在其他檢測(cè)器中引入了可變性或增加了測(cè)量噪聲，由于共享光譜區(qū)域，會(huì)導(dǎo)致信號(hào)分布更加發(fā)散，使分辨弱表達(dá)或稀有細(xì)胞群體的能力下降，尤其是當(dāng)標(biāo)志物為共表達(dá)時(shí)。（如圖3示例）
圖3：Spillover Spreading Error示例。此處的擴(kuò)散誤差被視為一種“魚(yú)尾狀模式"，其中PE-CY5信號(hào)溢出到Alexa Fluor647中中，導(dǎo)致CD3+CD56-的信號(hào)失真并使細(xì)胞群顯得比實(shí)際更寬，進(jìn)一步加劇了信號(hào)重疊，降低了CD3+CD56+ NKT細(xì)胞群的分辨率
Spillover Spreading Error的產(chǎn)生包含多種因素：
光子檢測(cè)的泊松分布性質(zhì)：其中較亮的信號(hào)固有地產(chǎn)生更多統(tǒng)計(jì)誤差
檢測(cè)系統(tǒng)的電子噪音
光譜重疊，特別是與明亮的熒光團(tuán)或高表達(dá)的標(biāo)志物共享探測(cè)器
因此即使的光譜解析，Spillover Spreading Error也無(wú)法消除，在高維多色實(shí)驗(yàn)和共表達(dá)標(biāo)記的分析中影響尤為明顯。
如何減輕Spillover Spreading Error的影響：
合理的Panel設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵：共表達(dá)markers間的熒光素選擇應(yīng)盡量減少擴(kuò)散誤差
使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照，如熒光減一對(duì)照（FMO），有助于確定熒光擴(kuò)散誤差對(duì)設(shè)門(mén)精度的影響
下表總結(jié)了影響光譜流式細(xì)胞術(shù)中Spillover Spreading Error的綜合因素。
下篇：應(yīng)用篇
除了熒光染料，樣本因素，儀器因素，對(duì)照設(shè)置的因素以外，光譜拆分算法對(duì)于Spillover Spreading Error的降低也發(fā)揮了重要的作用。CytoFLEX mosaic光譜模塊為用戶(hù)提供了兩種分解算法：經(jīng)典的LSM和貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)專(zhuān)有的混合泊松算法。
LSM算法是簡(jiǎn)單和被廣泛使用的方法。它假設(shè)噪聲出現(xiàn)在所有通道的水平是均一的，無(wú)論信號(hào)強(qiáng)度如何，所有檢測(cè)器都具有相同的信號(hào)強(qiáng)度方差。然而在實(shí)際情況下，這種假設(shè)通常不成立。比如檢測(cè)器在不同波段的噪音，以及抗體帶來(lái)的噪音等，因此導(dǎo)致解析的誤差，進(jìn)而加劇數(shù)據(jù)的溢出擴(kuò)散誤差（Spillover Spreading Error）。
混合泊松算法是基于光子發(fā)射的隨機(jī)性（泊松統(tǒng)計(jì)），對(duì)噪音信號(hào)進(jìn)行建模，提供了更真實(shí)的信號(hào)變異性反饋。
針對(duì)同一組樣本，這兩種算法的表現(xiàn)如何，我們通過(guò)一個(gè)案例研究來(lái)展示。
案例研究：10色方案設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)
以下的10色實(shí)驗(yàn)采用新鮮人外周血樣本，通過(guò)染色和裂紅處理，并在CytoFLEX LX mosaic光譜流式細(xì)胞儀上進(jìn)行了檢測(cè)，采用兩種光譜分解算法最小二乘法（LSM）和混合泊松算法（Poisson Hybrid）分別分析結(jié)果。
結(jié)果
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圖4：混合泊松算法與LSM算法在減少擴(kuò)散誤差方面的比較。使用一個(gè)10色Panel檢測(cè)人外周血中的主要細(xì)胞亞群，并使用混合泊松算法和LSM算法進(jìn)行解混。(A) 使用LSM（最小二乘法）算法解混的設(shè)門(mén)數(shù)據(jù)。(B) 使用混合泊松算法解混的設(shè)門(mén)數(shù)據(jù)。(C) 為所選門(mén)計(jì)算的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (rSD) 表明混合泊松算法減少了擴(kuò)散，突顯了僅靠溢出擴(kuò)散矩陣 (SSM) 評(píng)估分?jǐn)?shù)未能捕捉到的分辨率改善。(D) 比較兩種算法的SSM表顯示各檢測(cè)器的擴(kuò)散分?jǐn)?shù)差異
圖4A為L(zhǎng)SM和圖4B為混合泊松算法，細(xì)胞群P1，P2，P3和P4表現(xiàn)出兩種解析算法之間信號(hào)擴(kuò)散的明顯差異。圖4C定量地說(shuō)明了不同算法下通道間信號(hào)擴(kuò)散誤差的差異。在光譜解析中，陰性信號(hào)的rSD很重要，因?yàn)樗从沉诵盘?hào)分離的一致性和準(zhǔn)確性，較低的rSD值表明細(xì)胞群更緊密，這對(duì)于高維流式細(xì)胞術(shù)中細(xì)胞群的準(zhǔn)確識(shí)別和定量至關(guān)重要。圖4D所示的溢出擴(kuò)散矩陣 (SSM) 用于測(cè)量一個(gè)熒光染料的信號(hào)干擾到其他檢測(cè)通道的程度，較低的SSM值意味著熒光染料之間的干擾較小，從而產(chǎn)生更干凈的數(shù)據(jù)、更好的細(xì)胞群分離和更可靠的分析結(jié)果。以上結(jié)果均顯示，混合泊松算法提高了光譜解析的效率和準(zhǔn)確性。
需要注意的是，無(wú)論使用的抗體是否經(jīng)過(guò)滴定，此處顯示的結(jié)果在使用具有更多熒光染料、高度重疊染料或不同類(lèi)型樣品的不同panel時(shí)可能會(huì)有所不同。建議用戶(hù)切換解混算法以確定哪種算法適合其特定要求和實(shí)驗(yàn)條件。也就是說(shuō)，我們的研究表明，混合泊松算法有助于減少擴(kuò)散誤差，特別是在使用高度重疊染料組合的panel以及并非所有抗體都滴定的panel中。
溢出擴(kuò)散誤差（Spillover spreading error）和解混誤差（Unmixing error）是光譜流式細(xì)胞術(shù)中的主要挑戰(zhàn)，尤其是在高維Panel中，這些誤差源于生物和技術(shù)的原因，包括熒光染料亮度、光譜重疊、儀器配置和對(duì)照質(zhì)量等?？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化的Panel設(shè)計(jì)和對(duì)照選擇，使擴(kuò)散誤差最小化，這也是確?？煽康臄?shù)據(jù)解讀至關(guān)重要的一步。貝克曼庫(kù)爾特生命科學(xué)專(zhuān)有的混合泊松算法，使用LSM結(jié)果作為初始參數(shù)估計(jì)，然后結(jié)合了信號(hào)和噪聲的泊松特性，可進(jìn)一步降低數(shù)據(jù)的溢出擴(kuò)散誤差。
參考文獻(xiàn)（上下滑動(dòng)閱覽）
