密度梯度離心機在實驗中時如何進行操作的？

　　用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種。密度梯度離心常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。

 

　　分離活細胞的介質要求：

　　1、能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；

　　2、PH中性或易調為中性；

　　3、濃度大時滲透壓不大；

　　4、對細胞無毒。

 

　　密度梯度離心機的操作過程如下：

　　1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨后制成懸液,經反復凍融3次后,置-20℃冰箱中,備用。

　　2、先以5000g離心15分鐘后，獲取上清夜，然后再20000g高速離心30分鐘后取上清夜。

　　3、接著10萬g超速離心2h，將沉淀用少量STE溶解。

　　4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液，然后在離心管中依次加入30%,45%,60%的蔗糖,加的時候是用長針頭從底部往上加的。11萬g離心2.5h,發現在30%與45%以及45%與60%之間都有一條明亮的帶，用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來，分別收集到不同的瓶內。

　　5、去蔗糖；用STE緩沖液適量稀釋純化的病毒，然后11萬g離心3h,用少量STE緩沖液把沉淀懸起，即后獲得了純化的病毒。-20度凍純備用，用時可用分光光度計測定其病毒含量。

 

　　密度梯度離心機的注意事項：

　　離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續區帶。再通過虹吸、穿刺或切割離心管的方法將不同區帶中的顆粒分開收集，得到所需的物質。

　　1、梯度介質應具備足夠大的溶解度，以形成所需的密度梯度范圍。

　　2、梯度介質不會與樣品中的組分發生反應。

　　3、梯度介質也不會引起樣品中組分的凝集、變性或失活。

　　4、若離心時間過長由于顆粒的擴散作用，會使區帶越來越寬。為此，應適當增大離心力、縮短離心時間，可以減少由于擴散而導致的區帶擴寬現象。